我们有一系列的文章涵盖显微镜的各个方面。
一、背景及简介
本文涵盖了
有许多不同类型的显微镜，其中一些非常酷!
显微镜已成为一种必不可少的仪器现代科技．与此同时，科学家们从未放弃发明新型显微镜，不断突破极限，想要看到看不见的东西。
在这篇文章中，我们将向您介绍所有不同类型的显微镜。
[图中]当前显微镜的概述。
根据成像原理，可分为光学显微镜、电子显微镜和扫描探针显微镜。
光学显微镜成为一个非常强大的工具
大约500年前，安东尼·范·列文虎克(Antonie van Leeuwenhoek, 1632-1723)和罗伯特·胡克(Robert Hooke, 1635-1703)用他们的显微镜(在他们的时代，显微镜是最先进的“高科技”)带领我们进入微观世界。此后，以可见光为光源的光学显微镜技术迅速发展起来。
[在图中]回顾在现代技术发展中发挥重要作用的“古董”显微镜。如果你想了解更多关于他们的故事，请查看我们的文章“谁发明了显微镜?显微术的历史”。
图片来源:奥林匹斯山．
今天，显微镜的家族有了显著的扩展。在光学(或光学)显微镜的家族树中，原理仍然是相同的:“通过可见光和被测物的相互作用产生放大图像。”然而，科学家们已经取得了巨大的进步，可以看到更具体的(如荧光)、更深入的(如细胞和组织的3D图像)、更快的(如自动化系统)，甚至更小的(如超越光的衍射极限)。
[在此图中]显示光(光学)显微镜进化的家族树。
复合显微镜演化出各种各样的后代
[图中]图示了复合显微镜的各个部件。
复合显微镜(也称为直立光学显微镜)可能是你能找到的最常见的显微镜。术语“复合”是指具有多个透镜的显微镜。基本上，复合显微镜通过一对对准的显微镜产生放大的图像物镜和晶状体．一般来说，一个复合显微镜配备3-5个物镜，范围从4倍到100倍(4倍/10倍/40倍/63倍/100倍)。假设你有10倍的目镜和100倍的物镜，这个组合的总放大倍数是1000倍(10×100 = 1000)。
[在这张图中]从低倍到高倍看同一个标本。
最上面的原始是一系列豇豆(豌豆科)根尖的图片。在低倍率(5倍和10倍)下，你可以看到整个标本的全貌。通过靠近(放大倍率更高)，你会开始注意到细胞及其细胞核(蓝点)。在高倍放大(63倍和100倍的镜头浸油)，你可以看到一些核看起来不同于其他。这些纺锤状的细胞核正在分裂(或处于有丝分裂状态)，它们的染色体(DNA束)正在分开。开云体育电脑官网
复合显微镜的理想标本是又小又薄的东西，因为光必须穿过标本。复合显微镜具有更高的放大倍率来观察物体的细节;因此，复合显微镜又称高倍显微镜。下面是一些由复合显微镜拍摄的图像。
[图中]图像由复合显微镜拍摄。
A.轮虫(亮场);B.向日葵茎(染色薄段-亮场);C.鱼红细胞(染色-亮场);D.细菌(革兰氏碘染色-亮场);E.松杆(染色薄段-亮场+图像拼接);F. Rhoeo变色叶片(亮域+蓝色滤镜);G.人细胞培养皿培养(相位差);H.柠檬酸微晶(偏振光)。
基本的复合显微镜为开发许多其他类型的光学显微镜提供了一个通用的平台。通过使用特殊的电容器，复合显微镜还可以实现暗场、相位对比、偏振光和微分干涉对比(DIC)图像的特定应用。使用不同的光源，复合显微镜可以修改，以查看荧光，红外光，紫外光，甚至x射线。
复合显微镜可以设计用于不同的目的。例如，单目显微镜只有一个目镜，通常价格低廉。双目显微镜可以让你用两只眼睛看东西，适合学生使用。三眼显微镜有一个额外的第三眼管，用于连接显微镜相机。
有关如何选择复合显微镜的更多信息，请查看下面我们的博客。
立体显微镜向你展示一个立体的微观世界
立体显微镜是从其他显微镜中衍生出来的用于观察“3D”物体的应用。这些标本包括任何更实质性的标本，如昆虫、羽毛、树叶、岩石、沙粒、宝石、硬币和邮票等。
在功能上，立体显微镜就像一个更强大的放大镜。与提供平面图像的复合显微镜不同，立体显微镜给观察者一个三维图像，你可以看到标本的纹理。
[在这个图中]有标签的图表显示了立体显微镜的各个部分。
“立体”这个名字来源于“立体”这个词，意思是用两个不同的视角来创造一种深度和立体感的印象。因此，真正的立体显微镜只有双目和三眼两种。此外，与只能看到非常薄的标本的复合显微镜不同，立体显微镜几乎可以用来观察任何你能放在它下面的东西。然而，立体显微镜提供较低的放大倍率，通常为6.5x-45倍。下面的例子显示了复合显微镜和立体显微镜观察的区别。
[上图]复合显微镜和立体显微镜下的蚊子头．
立体显微镜能让你以三维视角观察标本的表面。在立体显微镜下，你可以看到蚊子复眼的金属纹理和颜色。相反，在复合显微镜下，光必须穿过标本才能形成图像。在这种情况下，复眼区域太厚，无法形成清晰的图像。
右图来源:Dr. Gareth Paul Jones, 2013显微摄影比赛，技术:立体显微，光纤照明。放大:70 x。
数码显微镜提供了方便和高质量的图像
显微镜是复杂的工具，对初学者可能不太友好。好消息是，我们现在可以很容易地购买和使用数码显微镜!
数字技术的最新进展导致了数字显微镜，它已经成为研究、教育和医疗实践的基本工具。通用数字显微镜可以包括与数字设备集成的任何显微镜，例如，在常规显微镜上增加一个数字相机。在大多数情况下，数字(或USB)显微镜已经成为一个术语来描述紧凑型显微成像凸轮，如下面的产品。
商业数码(或USB)显微镜的例子。
图片来源:亚马逊．
从功能上讲，数码显微镜提供的图像与传统显微镜提供的图像相似立体显微镜．它们是观察昆虫和岩石的理想场所。这些数码显微镜对于户外和野外研究也有很大的优势。
立体显微镜和数码显微镜都允许用户在显微镜下操作物体。你可能会发现许多应用，如解剖，显微外科，微型制造和微型雕刻。
【上图】米粒上的微雕。
倒置显微镜上下颠倒
倒置显微镜是颠倒设计的复合显微镜。传统的复合显微镜有时被称为直立显微镜。
[在这个图中]标签图显示了倒置显微镜的各个部分。
倒置显微镜在标本台下面有一个物镜，在上面有光源和聚光镜。倒置显微镜用于观察容器(例如，培养皿或组织培养瓶)底部的活细胞或生物体。一些倒置显微镜甚至配备了一个腔室，以在更自然的条件下保持温度和氧气，从而允许长时间的活细胞成像。
[图中]改良的倒置显微镜。左图:带有控制温度、湿度和CO的室的倒置显微镜2杠杆)用于活细胞成像。右图:带有两个微操作器的特殊倒置显微镜，可以进行体外受精(IVF)的微量注射。
图片来源:蔡司而且奥林匹斯山
[在这个视频中]在组织培养瓶中通过活体成像观察小鼠细胞(NIH-3T3)的生长超过64小时。
荧光显微镜照亮看不见的微观世界
荧光显微镜是一种光学显微镜荧光而不是其他光的性质(如散射、反射和吸收)来生成图像。
[在图中]惊人的荧光显微图像的美:(A)皮下的淋巴管和血管;(B)睾丸组织;(C)视网膜上的血管;(D)带有标记细胞骨架的细胞;(E)脊髓中的神经细胞;(F)发育中的心脏细胞。
图片来源:linktr.ee/immunofluorescence
荧光是一种光学现象，在这种现象中，以光子形式吸收的能量触发了具有较长波长的荧光光子的发射。根据光的性质，波长越长，能量越低。你可以想象，当光照射到一种物质上时，这种物质吸收了光的能量。一定数量的能量在材料内部损失;然后，这种材料以光的形式将剩余的能量发射回来(能量较低)。激发(入)和发射(出)光的光谱的变化被称为“荧光”。
荧光显微镜使我们能够观察具有特定光谱的特定荧光团。荧光显微镜和生化染色的结合已经成为生物医学研究的一个非常强大的工具。例如，通过使用抗体对抗原的特异性来标记细胞内的特定蛋白质或其他分子(一种称为免疫荧光的技术)，科学家可以研究常规光学显微镜通常看不见的各种生物分子。许多正在进行的帮助我们治疗疾病的研究，如糖尿病、心脏病发作和癌症，都使用这种工具在分子尺度上观察细胞内部的问题。
[图中]Alexa Fluor®488 phalloidin(绿色)和DAPI(蓝色)染色的血管细胞(内皮细胞)．
Alexa Fluor®488是一种广泛使用的荧光团，可以化学添加到其他分子和蛋白质。
图片来源:ThermoFisher科学
查看我们关于荧光显微镜原理．
共聚焦显微镜让你通过激光眼睛看到东西
共聚焦显微镜，最常被称为共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)，是一种荧光显微镜上的光学成像技术。共聚焦显微镜解决了光学显微镜的一个大问题:当你在观察厚标本时，由离焦部分发出的光导致图像模糊。在荧光显微镜下，整个标本被均匀地照射。样品的所有部分都可以同时被激发，发射荧光被显微镜的相机检测到，包括一个大的未聚焦的背景部分。
[图中]显示共聚焦显微镜威力的例子。
共聚焦显微镜可以通过去除离焦模糊来对厚标本进行光学切片。这15µm厚的小鼠肾组织在(A)宽视场和(B)激光扫描共聚焦显微镜上成像。
图片来源:Jonkman J等，细胞生物学方法，2014
相比之下，共聚焦显微镜使用点照明(通过聚焦激光束)和探测器前光学共轭平面上的针孔来消除失焦信号-“共聚焦”的名称源于这种配置。因此，只有荧光产生的光非常接近焦平面(在焦点)可以被检测到。
[图中]共焦原理。
来自焦点外部的荧光被针孔阻挡。因此，很大程度上消除了失焦模糊。
图片来源:杨克曼等，细胞生物学方法，2014
共聚焦显微镜不仅极大地提高了图像的光学分辨率，而且还使薄的“光学切片”成为可能。我们现在可以在几个焦平面上逐层扫描3D对象，收集连续切片的“z-stack”，然后处理所有切片以创建3D图像。
[在这个视频中]使用共聚焦3D显微镜观察小鼠视网膜中的细胞层。
基于共聚焦显微镜的原理，科学家们开发出了更先进的超级显微镜!例如,双光子显微镜允许我们看到非常厚的标本(>毫米)。光片荧光显微术可以以比传统共聚焦显微镜快100到1000倍的速度获取图像，这对研究活细胞非常有用。
[在此图中]使用双光子显微镜通过活老鼠的皮肤(几毫米厚)观察血管的例子。
图片来源:信号噪声杂志
超分辨率显微镜(SRM)超越了光的衍射极限
光学显微镜的光学分辨率受一组基本物理定律的支配——衍射极限。因此，光学显微镜可获得的最高点对点分辨率是用于成像标本的“光波长的一半”。比这个距离更近的两个物体在显微镜下是无法分辨的。
[图中]分辨率。
在光学显微镜中区分两个近距离物体的能力受到光的衍射极限的限制。基本上，(A)已经很好地分辨了光源，而(C)不能区分两个光源。(B)另一方面，它具有中等分辨率，会产生模糊的图像。
一般来说，波长越短，分辨率越高。实际的限制(绿灯)是~250nm。从长远来看，一个红细胞的大小是~8微米，一个细菌的大小是~1微米。病毒通常在100nm以下。单个平均蛋白质的大小约为5nm。因此，观察细胞中的单个分子是一个真正的挑战。
［这张相对大小图可以让你知道病毒有多小。
一个流感病毒颗粒比人类头发直径小600倍。
科学技术的进步，包括快速开云体育全站app下载安装激光、荧光标记和计算能力，使以前被认为在物理上不可能的事情现在成为可能。这些显微镜被称为超分辨率显微镜(SRM)，工作在衍射极限之外。2014年诺贝尔化学奖授予了该领域的3位先驱(Eric Betzig, Stefan W. Hell和William E. Moerner)。
［由共聚焦显微镜和超分辨率显微镜产生的图像之间的比较。
在本例中，超分辨率显微镜使用可见光谱中的光(5倍增强)使生物样品的结构分辨率降低到50 nm范围。
现在市面上有几种类型的光学显微镜可以根据不同的原理观察超精细结构和绘制大分子图。的例子是结构照明显微术(SIM),受激发射耗竭显微术(发生的),随机光学重建显微术(风暴),光激活定位显微镜(手掌)。
如果你想了解更多关于这些神奇工具的信息，请查看这个网站．
自动细胞成像系统帮助我们找到解药
随着计算机和机器人技术的发展，光学显微镜最近被集成到自动化系统中。这些自动化成像系统可以使用定义的参数查看和拍摄细胞图像。例如，每5分钟用10倍、20倍和40倍的放大率拍摄细胞照片，持续48小时。
通常，这些系统包括一个细胞培养室，可以保持细胞生长数天。细胞可以在小孔中生长，并且可以同时监测数百个这样的孔。一些系统甚至配备了机械手，可以向单个井中添加不同的化学物质。用不同化学物质处理过的细胞将被成像系统检查，以找出特定化学物质的影响。许多制药公司正在利用这种方法寻找新药。高通量筛选”系统。有些甚至使用人工智能(AI)来诊断人类无法判断的细胞微小变化。
［的一个例子自动细胞成像系统集成照相机、细胞培养和机器人．
图片来源:BioTek．
电子显微镜(EM)以不同的方式观察事物
除了光学显微镜，科学家们还发明了显微镜，用其他方法来产生图像。正如我们前面提到的，光学显微镜的分辨能力受到光的性质的限制。为了看到更小的物体，科学家们必须找到波长比可见光短得多的照明。在20世纪30年代初，他们意识到电子可以做到这一点，从而发展出电子显微镜(EM)。
[在图中]一个专门研究中心的透射电子显微镜。
图片来源:亚历山大·费舍尔-瓦格纳/加州大学戴维斯分校。
电子显微镜通过在样品上发射加速电子束来生成图像。根据现代物理学，电子既具有粒子的性质，又具有波的性质。因此，电子有一个波长(称为德布罗意波长)，取决于它的能量(或速度)。例如，如果一个电子在真空管中加速到每秒1,000,000米(等于每小时220万英里!)，我们得到的德布罗意波长大约是十分之一纳米，大约是一个原子的大小。这就是为什么我们可以用电子显微镜“看到”比光学显微镜小得多的结构。
[在图中]电子显微镜可以看到超级微小的东西，比如病毒。
冠状病毒的EM图像显示晕状或冠状(冠状)外观。原始的电子显微镜图像总是黑白的。颜色是人为绘制的，以便更好地显示(右)。
图片来源:CDC。
扫描电子显微镜可以看到纹理
SEM是扫描电子显微镜的缩写。扫描电镜是一种电子显微镜，它使用一束聚焦的电子来扫描样品的表面。扫描电镜图像可以深入了解样品的表面形貌;因此，它可以生成3d图像。
[在图中]成纤维细胞的扫描电镜图像。
成纤维细胞是一种合成结缔组织的细胞外基质和胶原蛋白的细胞。扫描电镜图像可以看到细胞表面的各种细胞突起和细胞外基质。
图片来源:tescan.com
透射电子显微镜见切片
TEM是透射电子显微镜的缩写。TEM是一种电子显微镜，它使用宽电子束来创建样品内部结构的图像。一束电子束通过样品形成图像。样品必须非常薄，通常小于150纳米厚，以允许电子通过。因此，TEM生成二维图像。下图是TEM图像示例。
[在图中]胰腺导管腺癌(PDAC)癌细胞的TEM图像。
PDAC是西方国家最致命的癌症之一。科学家从这张TEM图像中了解到，异常的线粒体有助于癌细胞的生长。(来源:MD安德森癌症中心高分辨率电子显微镜设备)
扫描探针显微镜通过抓挠表面来观察微观世界
另一组显微镜，统称为扫描探针显微镜(SPM)，使用非常小的探头扫描物体表面以生成图像。你可以想象你用手指去感受棉布的质地，但是是在原子尺度上。事实上，这些扫描探针显微镜就像原子力显微镜(AFM)可以在单原子分辨率下检测表面上下(拓扑)。这种探针甚至可以移动和排列单个原子。
[在图中]原子力显微镜(AFM)提供了表面拓扑的精确信息。
AFM在悬臂上使用一个非常小的探针来扫描物体表面。探针尖端与表面原子之间的相互作用在悬臂上产生了微小的力，可以被激光探测到。通过缓慢移动探针，在每个点检测到的力可以以超高分辨率生成样本表面的三维形状(地形)图。
图片来源:压电式喷墨技术。
［在这张图中扫描探针显微镜的能力。spm家族正在壮大。通过使用不同的探针，科学家们可以探测到探针尖端和样本之间在原子尺度上非常微弱的相互作用(例如，抗体-抗原)。
图片来源:自然纳米技术。
一个男孩和他的原子:世界上最小的电影．
这部电影是由IBM研究人员使用扫描隧道显微镜(STM)逐个移动数千个一氧化碳分子生成的。
总结
如果你想探索微观世界，显微镜是很神奇的工具。在这篇文章中，我们学到了:
- 根据产生图像的原理，显微镜可分为三种类型:光(光)，电子,扫描探针显微镜。
- 光学显微镜已有500多年的历史。不同的光学显微镜形成了一个庞大的家族树，它们仍在发展中。
- 复合显微镜有一个以上的透镜，以产生高倍率图像的平面，薄标本。
- 立体显微镜是观察三维物体表面纹理的理想工具。
- 荧光显微镜可以看到特定光谱的荧光灯。科学家们使用荧光显微镜和抗体来研究细胞内看不见的分子。
- 许多很酷的技术可以解决传统光学显微镜的局限性。共聚焦显微镜就是一个很好的例子，它可以去除不需要的离焦模糊，并以3D方式看到细胞结构。
- 新的显微镜系统与计算机和机器人集成在一起，每周7天，每天24小时自动进行药物发现。
- 光的衍射极限限制了传统光学显微镜的使用。
- 超分辨率显微镜是一个活跃而令人兴奋的研究领域，它可以让我们看到超出衍射极限的微小物体。
- 另一种观察小物体的方法是用电子豆代替可见光。这些类型的电子显微镜(EM)可分为SEM和TEM。
- 扫描探针显微镜使用一个非常微小的探针来检测单个原子尺度上的表面拓扑结构。
参考
Greenfluorescentblog的“数值孔径和分辨率”
