本文将介绍
什么是荧光显微镜?
荧光显微镜是一种光学显微镜荧光而不是其他光的性质(如散射、反射和吸收)来生成图像。这个类别包括一个更简单的设置，如荧光显微镜数字化还有更复杂的设计，比如共焦显微镜、双光子显微镜和光片显微镜。
荧光是什么?
在我们了解荧光显微镜是如何工作的之前，我们最好快速了解什么是“荧光”。
荧光是一种光学现象，在这种光学现象中，光子形式的能量的吸收触发了波长较长的荧光光子的发射。根据光的性质，波长越长，能量越低。你可以想象当光照射到一种材料上时，这种材料会吸收光的能量。一定数量的能量在材料内部损失;然后这种材料以光的形式将剩余的能量发射回来(能量较低)。激发(内)和发射(外)光光谱的变化称为“荧光”。
(此图)(A)荧光的物理基础由电子状态图(所谓的雅布隆斯基图)来说明。它首先由荧光团吸收较高的光子能量，随后发射较低的光子能量，从而产生荧光。(B)典型的激发-发射图，显示荧光团在较短波长(即较高能量)时的吸收光谱和在较长波长(即较低能量状态)时发射光的合成荧光光谱。
图片来源:世界精密仪器
荧光的一个很好的例子发生在黑光影院，比如蓝人剧团。表演者穿着涂有荧光染料的衣服，这些染料吸收紫外线(肉眼看不见的黑色光线)，然后发出可见光(蓝色、绿色或红色)。这些荧光化合物被称为"荧光团”。
(此图)具有不同颜色荧光的珊瑚。
图片来源:reefs.com
自然界中也经常能发现荧光:在某些矿物和动物的不同部位，如深海鱼、珊瑚和水母。科学家甚至可以通过基因工程使生物携带各种荧光蛋白。
[在这张图中]基因工程荧光生物。
(A)用表达8种不同颜色荧光蛋白的活细菌在培养皿上作画(来自Roger Tsien的实验室)。GloFish，第一个商业化的荧光宠物，使用生物技术创造。(C)将绿色荧光蛋白(GFP)插入小鼠基因组用于神经学研究。
图片来源:维基，家，Proteopedia．
荧光显微镜是如何工作的?
一旦我们知道了什么是荧光，荧光显微镜的原理就变得简单了。要用光学显微镜检测荧光，有三个步骤:
一、标本被荧光团吸收的特定波长的光照射，使荧光团能够发出较长波长的光。
2通过使用光谱发射滤光片，可将照明光从较弱的发射荧光中分离(滤出)。
3发射的光被照相机或我们的眼睛收集。
大多数荧光显微镜，特别是那些用于生命科学和生物医学研究的，是表观荧光显微镜。开云体育全站app下载安装他们的设计如下图所示。
(此图)附荧光显微镜的光程
让我们看看这个表观荧光设计的光程。
(1)荧光显微镜需要强烈的光源这是卤素灯无法提供的。氙气弧灯或汞蒸气灯是常见的，更高级的形式是高功率led或激光。
(2)激励滤波器用于从光源中选择光的特定激励波长。例如，在这张图中，只有“蓝色”光可以通过励磁滤波器。
(3)二色镜(或二色分束器)可以通过光的发射和反射作为波长的函数来分离光。“蓝色”激发光被二色镜反射到样品上。
(4)“蓝色”激发光穿过物镜。
(5)“蓝色”激发光照亮试样。绿色荧光蛋白(GFP)等荧光团发出“绿色”发射光。
(6)“绿色”发射光通过物镜返回(与普通光学显微镜相同)。
(7)二色镜允许传输“绿色”发射光。
发射滤光片是用来滤掉不需要的波长的光的。
(9)“绿色”发射光通过晶状体形成图像。
最后的图像由探测器(通常是非常灵敏的照相机)记录下来。
荧光显微镜图像的独特之处是什么?
基于荧光显微镜的原理，可以看到荧光显微镜图像的这些独特特征。科学家可以将荧光显微镜的这些独特特性转化为优势，为他们的研究提供动力:
只能看到匹配的荧光团
你将看不到任何东西(黑色背景)，而只能看到与所选激发/发射光谱相匹配的被照亮的荧光团。通过这种方式，我们可以看到混合物中非常特定的分子。
(此图)培养皿中人类细胞的相位对比和荧光显微镜图像。
带有相位对比滤光片的光学显微镜可以显示细胞的整体形态。荧光显微镜可用于检测小部分细胞中绿色荧光蛋白(GFP)发出的绿色荧光。在计算机软件中，你可以将两者叠加成一张合成的图像。
B.激励滤波器、二色镜和发射滤波器必须与样品中的荧光团光谱相匹配
选择滤波器和二色镜来匹配样品中使用的荧光团的光谱激发和发射特性。激振发射滤波器组通常设计为一个模块。为了看到不同的荧光颜色，你需要切换到正确的模块。
[在此图中]使用不同的过滤器组在同一位置查看不同的荧光团的例子。
这是两种细胞的混合物:一种携带绿色线粒体，另一种携带红色线粒体。当你使用专为绿色荧光设计的激发/发射(488/520 nm)滤波器组时，你看不到任何来自红色荧光团的信号(即使它们也在那里)。这为科学家追踪细胞内特定种类的蛋白质带来了巨大的好处。
C.荧光显微镜下的图像是单色的
由于一个滤光片模块专门处理一个荧光团，所以每次只对单个荧光团(颜色)的分布进行成像。通过这种方式，荧光显微镜拍摄的原始图像是单色的(黑白)。多种类型荧光团的多色图像必须通过组合多幅单色图像进行叠加。
(此图)由三个单独拍摄的荧光图像组合生成的多色图像示例。这种技术(称为共定位)在生物医学研究中非常有用，可以研究不同蛋白质之间的相互作用。
样品制备是荧光显微技术的关键
什么是荧光显微镜的好样本?一定是荧光的。有几种方法可以创建荧光样品:
A.生物荧光染色剂
许多荧光分子被设计用来染色一系列的细胞结构和生物分子。其中一些是本质上具有荧光的小分子，并与感兴趣的生物分子结合。例如，DAPI和Hoechst(由UV波长光激发)是核酸染料，与DNA强烈结合，从而标记细胞的细胞核。另一个例子是phalloidin，它最初是一种来自死亡帽菇的毒素。通过添加荧光团染色细胞骨架肌动蛋白丝来修饰Phalloidins。
[本图中]Alexa Fluor®488 phalloidin(绿色)和DAPI(蓝色)染色的血管细胞(内皮细胞)．
Alexa Fluor®488是一种广泛使用的荧光团，可以化学添加到其他分子和蛋白质。
图片来源:ThermoFisher科学
b .免疫荧光
免疫荧光是一种利用抗体对抗原的特异性来标记细胞内特定蛋白质或其他分子的技术。
(此图)抗体是我们免疫系统中B细胞产生的一种蛋白质。
抗体可以特异性地与匹配的抗原结合。例如，抗原可能是细菌的组成部分。抗体与抗原的结合可以消除我们体内的抗原来源。
创建BioRender.com
免疫荧光步骤
用针对相关分子(抗原)的一抗处理标本。接下来，添加一种专门与第一抗体结合的二抗。荧光团通常结合在二抗上进行成像。通常情况下，多个二抗可以与一个一抗结合，导致荧光信号的极大放大。
(此图)免疫荧光染色的程序。
初级抗体寻找并与它们匹配的抗原结合。接下来，在反应中加入一种专门与一抗结合的二抗(一抗体是二抗体的抗原)。
c .荧光蛋白
现代生物技术的进步使科学家能够从基因上改造蛋白质，使有机体能够携带荧光蛋白。这一原理允许科学家直接将感兴趣的蛋白质变成荧光。这种蛋白质在细胞内的定位可以直接追踪，包括在活细胞中。相比之下，免疫荧光染色通常需要固定细胞，使用化学物质杀死细胞。
(此图)(A)绿色荧光蛋白(GFP)的蛋白质结构。绿色荧光蛋白是最著名的荧光蛋白。它是从水母中分离出来的Aequorea Victoria．(B)各种颜色的荧光蛋白的收集。这些荧光蛋白中有许多来自于原始GFP的突变。科学家Roger Y. Tsien、Osamu Shimomura和Martin Chalfie因发现和开发这种绿色荧光蛋白而被授予2008年诺贝尔化学奖。
图片来源:化学Soc牧师，Exploreable
(此图)基因编辑DNA产生“融合蛋白”通过添加GFP像标签的蛋白质感兴趣。使用这种技术，科学家可以研究亚细胞位置的各种靶标(他们感兴趣的蛋白质)。
图片来源:化学Soc牧师
荧光显微镜的缺点
尽管荧光显微镜是生命科学和生物医学研究中许多重要发现背后的强大技术，但它也有局限性:开云体育全站app下载安装
答:光褪色
在经过一段时间的光照后，荧光团会失去荧光能力，这一过程被称为光漂白。光漂白发生在荧光分子由于吸收能量而积累化学损伤。光漂白会严重限制通过荧光显微镜观察样品的时间。
B.同时查看多个目标的限制
荧光光谱的窗口是有限的。一台典型的荧光显微镜可能只有三套用于绿色、红色和蓝色荧光的滤镜。另外，如果两个荧光团的激发/发射光谱重叠或太接近，则不能一起使用。对于免疫荧光，抗体(包括初级抗体和次级抗体)的可用性也可能限制在同一标本中可以看到的颜色的数量。
c .衍射极限
由于衍射极限，光的波动特性限制了光可以聚焦到的光斑的大小。和其他光学显微镜一样，荧光显微镜的分辨率仍然受光的性质所控制(分辨率约为所用光波长的一半)。
最近，显微镜技术的一些改进在一定程度上提高了分辨率和对比度。例子包括双光子激发显微镜和受激发射损耗显微镜。我们将在以后的文章中讨论高级显微镜。
d .昂贵的
与复合显微镜或立体显微镜相比，荧光显微镜仍然相当昂贵(10,000美元)。这并不奇怪，因为荧光显微镜要复杂得多。如果您对荧光显微镜感兴趣，请关注您当地大学或研究机构的开放之家或科学活动。
参考
“荧光蛋白调色板:细胞成像工具”理查德N.戴和迈克尔W.戴维森
